Us Food And Drug Administration

Bakteriologisk Analytisk Manual (BAM) Hovedside

Forfatter: Robert Blodgett (pensjonert)

For ytterligere Informasjon, kontakt: Stuart Chirtel eller Guodong Zhang

Revisjonshistorikk:

• oktober 2020: mpn kalkulator app lagt
• April 2015: Kontakt For Dette Tillegget ble oppdatert
• oktober 2010: Ligning for mest sannsynlig nummer (MPN) erstattet med grafisk versjon; Lagt ekspansiv notat for det nedlastbare regnearket
• juli 2003: Lagt Til Tabell 5. for 10 rør ved 10 ml inokula og lenke til regneark

Bakgrunn

Tabeller

Bakgrunn

Serielle fortynningstester måler konsentrasjonen av en målmikrobe i en prøve med et estimat kalt det mest sannsynlige tallet (MPN). MPN er spesielt nyttig for lave konsentrasjoner av organismer (<100/g), spesielt i melk og vann, og for de matvarer som har partikler som kan forstyrre nøyaktig koloni teller. Følgende bakgrunnsobservasjoner er tilpasset og utvidet fra artikkelen PÅ MPN Av James T. Peeler og Foster D. McClure I Bacteriological Analytical Manual (BAM), 7th edition.

Bare levedyktige organismer er nummerert AV mpn-bestemmelsen. Hvis, i mikrobiologens erfaring, bakteriene i den preparerte prøven i spørsmålet kan bli funnet festet i kjeder som ikke er adskilt av forberedelse og fortynning, BØR MPN vurderes som et estimat av vekstenheter (GUs) eller kolonidannende enheter (Cfu) i stedet for individuelle bakterier. For enkelhet vil dette vedlegget imidlertid snakke om Disse Gus eller Cfu som individuelle bakterier. Hvis en bekreftelsestest innebærer å velge kolonier som skal testes, bør det brukes en statistisk justering som ikke er omtalt i dette vedlegget (se Blodgett 2005a.)

følgende forutsetninger er nødvendige for å støtte MPN-metoden. Bakteriene fordeles tilfeldig i prøven. Bakteriene er separate, ikke gruppert sammen, og de avviser ikke hverandre. Hvert rør (eller plate, etc.) hvis inokulum inneholder enda en levedyktig organisme vil produsere påviselig vekst eller forandring. De enkelte rørene i prøven er uavhengige.

essensen AV mpn-metoden er å fortynne prøven i en slik grad at inokula i rørene vil noen ganger, men ikke alltid inneholde levedyktige organismer. «Utfallet», dvs. antall rør og antall rør med vekst ved hver fortynning, vil innebære et estimat av den opprinnelige, ufortynnede konsentrasjonen av bakterier i prøven. For å oppnå estimater over et bredt spekter av mulige konsentrasjoner, bruker mikrobiologer serielle fortynninger som inkuberer rør ved flere fortynninger.

MPN er tallet som gjør det observerte utfallet mest sannsynlig. Det er løsningen for λ, konsentrasjon, i følgende ligning

hvor exp (x) betyr ex, og

k angir antall fortynninger,
gj angir antall positive (eller vekst) rør i jth fortynning,
mj angir mengden av den opprinnelige prøven satt i hvert rør i jth fortynning,
tj angir antall rør i jth fortynning.

generelt kan denne ligningen løses ved iterasjon.

McCrady (1915) publiserte den første nøyaktige estimeringen av antall levedyktige bakterier VED MPN-metoden. Halvorson Og Ziegler (1933), Eisenhart Og Wilson (1943) og Cochran (1950) publiserte artikler om det statistiske grunnlaget FOR MPN. Woodward (1957) anbefalte AT mpn-tabeller skulle utelate de kombinasjonene av positive rør (høye for lave konsentrasjoner og lave for høye konsentrasjoner) som er så usannsynlige at de reiser bekymringer om laboratoriefeil eller forurensning. De Man (1983) publiserte en konfidensintervallmetode som ble endret for å lage tabellene for dette vedlegget.

Konfidensintervall

95 prosent konfidensintervall i tabellene har følgende betydning:

før tubene inokuleres, er sjansen minst 95 prosent for at konfidensintervallet knyttet til det endelige resultatet vil omslutte den faktiske konsentrasjonen.

det er mulig å konstruere mange forskjellige sett med intervaller som tilfredsstiller dette kriteriet. Denne håndboken bruker en modifikasjon av metoden til De Man (1983). De Man beregnet sine tillitsgrenser iterativt fra de minste konsentrasjonene oppover. Fordi denne håndboken legger vekt på patogener, har intervallene blitt skiftet litt oppover ved å iterere fra de største konsentrasjonene nedover.

konfidensintervallene i regnearket og tabellene knyttet til dette vedlegget kan være forskjellige. MPN Excel-regnearket bruker en normal tilnærming til loggen (MPN) for å beregne konfidensintervallene. Denne tilnærmingen ligner en normal tilnærming diskutert I Haldane (1939). Denne tiln rmingen er mindre beregningsmessig intens, sa mer passende for et regneark enn De Manns konfidensintervaller.

Presisjon, Bias Og Ekstreme Utfall

MPNs-og konfidensgrensene er uttrykt til 2 signifikante sifre. For eksempel er oppføringen » 400 » avrundet fra et tall mellom 395 og 405.

Tallrike artikler har notert en bias mot overestimering AV mikrobielle konsentrasjoner av MPN. Garthright (1993) har imidlertid vist at det ikke er noen merkbar bias når konsentrasjonene uttrykkes som logaritmer, de vanlige enhetene som brukes til regresjoner og for å kombinere utfall. Derfor har Disse Mpnene ikke blitt justert for bias.

utfallet med alle positive tuber i hver fortynning gir ingen øvre grense for konsentrasjonen. Tabellene i dette tillegget viser MPN for dette utfallet som større enn det høyeste MPN for et utfall med minst ett negativt rør. På samme måte er utfallet med alle negative rør oppført som mindre ENN det laveste MPN for et utfall med minst ett positivt rør.

Advarsler

Usannsynlige Utfall

Flere potensielle problemer kan forårsake usannsynlige utfall. For eksempel kan det være forstyrrelser ved lave fortynninger eller å velge for få kolonier ved lave fortynninger for en bekreftelsestest kan overse målmikroben. Hvis problemet antas begrenset til de lave fortynningene, kan det være mer pålitelig å bruke bare de høye fortynningene med positive rør. Hvis årsaken til problemet er ukjent, kan estimatet være upålitelig.

når man ekskluderte usannsynlige utfall, ble De Man ‘ S (1983) foretrukne grad av usannsynlighet vedtatt. Resultatene inkludert er blant de 99.985 prosent mest sannsynlige utfall hvis deres Egne MPNs var de faktiske bakteriekonsentrasjoner. Derfor, blant 10 forskjellige utfall, vil alle bli funnet i disse tabellene minst 99 prosent av tiden.

Ufullstendige Rør

i spesielle tilfeller der rør ikke kan bedømmes enten positive eller negative (f. eks., plater overgrodd av konkurrerende mikroflora ved lave fortynninger), bør disse rørene utelukkes fra utfallet. Resultatet kan ha forskjellig antall rør enn noen av tabellene i dette vedlegget. DENS MPN kan løses av datalgoritmer eller estimert Av Thomas ‘ Regel nedenfor. Haldanes metode kan finne konfidensgrensene som beskrevet Under Thomas ‘ regel.

Bruk Av Tabeller

Valg Av Tre Fortynninger For Tabellreferanse

En MPN kan beregnes for et hvilket som helst positivt antall rør ved et hvilket som helst positivt antall fortynninger, men ofte bruker serielle fortynninger tre eller flere fortynninger og en desimal serie (Hver fortynning har en tiendedel så mye av den opprinnelige prøven som den forrige fortynningen.) Tabellene i dette vedlegget krever å redusere et utfall til tre av sine desimalfortynninger. Denne prosedyren for å velge tre fortynninger ble utviklet for designene (antall rør per fortynning og forholdet mellom fortynninger) i disse tabellene. De har alle desimalfortynninger og et ganske lite antall rør per fortynning. For andre design kan andre prosedyrer være nødvendig. Når MPN-modellen holder, blir de tre desimalfortynningene valgt for å gi en god tilnærming TIL MPN for hele utfallet. Ellers kan reduksjonen fjerne interferens (mulig fra en annen type mikrobe eller et giftig stoff) som kan fortynnes ut. Resten av denne delen forteller hvordan du velger de tre fortynninger.

fjern først den høyeste fortynningen (minste prøvevolum) hvis den og den neste nedre fortynningen har alle negative rør. Så lenge denne tilstanden holder og minst fire fortynninger forblir, fortsett å fjerne disse fortynningene.

Neste, hvis bare tre fortynninger forblir, bruk dem som illustrert I eksempel A. i hvert eksempel er det fem rør i hver fortynning. I eksempel A, fjerner de to høyeste fortynningene (0,001 og 0,01 gram) tre fortynninger.

hvis mer enn tre fortynninger forblir, finn den høyeste fortynningen med alle positive rør. Det er tre tilfeller. I det første tilfellet er den høyeste fortynningen med alle positive rør innenfor de tre høyeste gjenværende fortynningene. Bruk deretter de tre høyeste gjenværende fortynningene. I eksempel B fjerner det første trinnet den høyeste fortynningen (0,001 gram.) Siden den høyeste fortynning med alle positive rør (1 gram) er innenfor de tre høyeste gjenværende fortynninger, (1, 0,1, og 0,01 gram,) bruke dem. I eksempel C er den høyeste fortynningen med alle positive rør (0,01 g) innenfor de tre høyeste gjenværende fortynningene (0,1, 0,01 og 0,001.)

i andre tilfelle er den høyeste fortynningen med alle positive rør ikke innenfor de tre høyeste gjenværende fortynningene. Velg deretter de neste to høyere fortynningene enn den høyeste fortynningen med alle positive rør. Tilordne summen av de positive rørene av noen fortsatt høyere fortynninger til den tredje høyere fortynningen. I eksempel D har den høyeste fortynningen med alle positive rør 1 gram. Velg de to fortynningene umiddelbart høyere som har 0,1 og 0,01 gram. Det er bare en høyere fortynning hvis positive rør er tildelt for å danne den tredje fortynningen med 0,001 gram.

i tredje tilfelle er det ingen fortynning med alle positive rør. Velg deretter de to laveste fortynningene. Tilordne summen av de positive rørene av høyere fortynninger til den tredje fortynningen. I eksempel e ingen fortynning har alle positive rør. De to laveste fortynningene har 10 og 1 gram. Summen av de positive i fortynningene med 0,1, 0,01 og 0,001 gram er tildelt for å danne den tredje fortynningen med 0,1 gram.

hvis de tre fortynningene som er valgt, ikke er i tabellene, var noe i seriell fortynning sannsynligvis uvanlig. Dette er en advarsel om at utfallet er tilstrekkelig usannsynlig at de grunnleggende antagelsene TIL MPN kan være tvilsomme. Hvis det er mulig, kan gjenta testen være den mest pålitelige prosedyren. Hvis EN MPN-verdi fortsatt er onsket, bruk de tre hoyeste resterende fortynningene. I Eksempel F brukes de tre høyeste fortynningene. Hvis disse fortynningene ikke er i tabellene, bruk den høyeste fortynningen med noen positive rør. Seksjonen med tittelen ‘MPN for en enkelt fortynning med noen positive rør’ viser hvordan du beregner MPN.

Konvertering Av Tabellenheter

tabellene nedenfor gjelder for inokula på 0,1, 0,01 og 0,001 g. når forskjellige inokula er valgt for tabellreferanse, multipliserer MPN / g og konfidensgrenser med den multiplikatoren som gjør at inokulaen samsvarer med tabellens inokula. For eksempel, hvis inokula var 0,01, 0,001, og 0,0001 med tre rør per fortynning, multiplisere med 10 ville gjøre disse inokula matche tabellen inokula. Hvis utfallet var (3, 1, 0), multipliser Tabellen 1 mpn / g estimat, 43 / g, med 10 for å komme til 430 / g.

Grenser og tilnærminger for et design uten tabell

MPN for en seriell fortynning ikke adressert av noen tabell (f. eks som følge av utilsiktet tap av noen rør) kan beregnes ved iterasjon eller avgrenset som følger.

Hvor W og Q er to disjoint sett med fortynninger som sammen inneholder alle fortynninger. Den nedre grensen tillater lave fortynninger med alle positive rør som skal slettes fra bundet. Blodgett (2005b) introduserer disse og andre grenser.

følgende gir et estimat AV MPN. Velg først den laveste fortynningen som ikke har alle positive rør. For det andre, velg den høyeste fortynningen med minst ett positivt rør. Til slutt velger du alle fortynninger mellom dem. Bruk bare de valgte fortynningene i Følgende Formel Av Thomas (1942):

MPN/g = (∑ gj) / (∑ tjmj ∑ (tj-gj)mj) (½)

hvor summering over den valgte fortynninger og

∑ gj angir antall positive rør i valgt fortynninger,

∑ tjmj betegner gram av prøven i alle rørene i den valgte fortynninger,

∑ (tj-gj)mj betegner gram av prøven i alle negative rør i valgt fortynninger.

følgende eksempler vil illustrere Anvendelsen Av Thomas formel. Vi antar at fortynningene er 1,0, 0,1, 0,01, 0,001 og 0,0001 g.

Eksempel (1). For utfallet (5/5, 10/10, 4/10, 2/10, 0/5) bruk bare (–,–, 4/10, 2/10,–); så ∑ tjmj = 10*0.01 + 10*0.001 = 0.11. Hvor * betyr multiplikasjon. Det er 6 negative rør ved 0.01 og 8 negative rør ved 0.001, så ∑ (tj-gj)mj = 6*0.01 + 8*0.001 = 0.068. Det er 6 positive rør, så

MPN/g = 6/(0.068 * 0.11)(½) = 6/0.086 = 70/g

Eksempel (2). For utfallet (5/5, 10/10, 10/10, 0/10, 0/5) bruk bare(–, –, 10/10, 0/10,–), Så Ved Thomas formel,

MPN/g = 10 / (0,01 * 0,11) ( ½ ) = 10/.0332=300 / g

disse to tilnærmet Mpnene sammenligner godt med Mpnene for henholdsvis (10, 4, 2) og (10,10,0) (dvs.70/g og 240/g).

Omtrentlige konfidensgrenser for ethvert resultat av fortynningstest kan beregnes ved først å estimere standardfeilen til log10 (Mpn) Ved Metoden Til Haldane. Vi beskriver metoden for 3 fortynninger, men den kan forkortes til 2 eller utvides til et positivt tall.

La m1, m2, m3 betegne inokuleringsmengdene på de største til de minste mengdene (f. eks. m1 = 0,1 g, m2 = 0,01 g, m3 = 0,001 g i disse tabellene).

La g1, g2, g3 angi antall positive rør ved de tilsvarende fortynningene. For lesbarhet betegner vi yx med «y * * x» og «y ganger x» med «y * x».

nå beregner vi

T1 = exp (- mpn * m1), T2 = exp (- mpn*m2), etc.

så beregner vi

B = + … + .

til slutt beregner vi

Standard Feil På Log10(mpn) = 1 / (2.303*mpn * (B**0.5))

nå er 95 prosent konfidensintervaller, for eksempel, funnet på

Log10 (mpn) ± 1.96*(Standardfeil).

MPN for En Enkelt Fortynning Med Noen Positive Rør

Hvis bare en fortynning har noen positive rør, gir et enklere uttrykk SIN MPN.

MPN/g = (1/m) * 2.303 * log10 ((∑tjmj)/ (∑(tj-gj)mj))

hvor m betegner mengden prøve i hvert rør i fortynningen med et positivt rør.

Spesielle krav og tabeller inkludert

det vedlagte regnearket skal kunne håndtere de fleste spesialiserte design. Garthright og Blodgett (2003) diskuterer dette regnearket. Forespørsler om spesielle beregninger og ulike design vil bli hedret som ressurser tillatelse. Design kan bli bedt om med mer eller mindre enn 3 fortynninger, ujevnt antall rør, forskjellige konfidensnivåer, etc. (Telefon 301-436-1836 eller skriv Divisjon For Matematikk, FDA/CFSAN, 5100 Paint Branch Parkway, HFS-205 Rm 2d-011, College Park, MD 20740) de mest publiserte designene, tre 10-ganger fortynninger med 3, 5, 8 eller 10 rør ved hver fortynning, presenteres her.

Klikk på lenken https://mpncalc.galaxytrakr.org/ for å automatisk beregne mpn-punktestimatet og konfidensintervallene av varierende nivåer (80%, 90%, 95% eller 99%). Konfidensintervallet metoden implementert i dette programmet bruker stor prøve teori tilnærming Av Jarvis et al. (2010), Med en liten endring For Alle positive eller alle negative tilfeller Ferguson og Ihrie (2018) og skiller SEG fra bam-tabellene konfidensintervaller som bruker de Man-metoden. Webapplikasjonen beregner også sjeldenhetsindeksen, Jarvis et al. (2010) Og Blodgett RJ (2002), en vurdering av hvor sannsynlig det observerte eksperimentelle resultatet er.

1. Blodgett, Rj 2005a. Seriell fortynning med et bekreftelsestrinn. Mat Mikrobiologi 22: 547-552.
2. Blodgett, Rj 2005b. Øvre og nedre grenser for en seriell fortynningstest. Tidsskrift FOR DEN AOAC internasjonale 88 (4):1227-1230.
3. Blodgett RJ (2002). «Måling av usannsynlighet for utfall fra en seriell fortynningstest.»Kommunikasjon I Statistikk: Teori og Metoder, 31 (12), 2209-2223. https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1081/STA-120017222
4. Cochran, W. G. 1950. Estimering av bakterielle tettheter ved hjelp av «Mest Sannsynlige Tall.»Biometri 6: 105-116.
5. Av Man, J. C. 1983. MPN tabeller, korrigert. Eur. J. Appl. Bioteknologi. 17:301-305.
6. Eisenhart, C. Og P. W. Wilson. 1943. Statistiske metoder og kontroll i bakteriologi. Bakteriol. Åp 7:57-137.
7. Ferguson M, Og Ihrie, J (2018). MPN: Mest Sannsynlige Tall Og Andre Mikrobielle Opplistingsteknikker. https://CRAN.R-project.org/package=MPN
8. Garthright, We og Blodgett, Rj 2003, FDAS foretrukne mpn-metoder For Standard, store eller uvanlige tester, med et regneark. Mat Mikrobiologi 20:439-445.
9. Garthright, W. E. 1993. Bias i logaritmen av mikrobielle tetthetsestimater fra serielle fortynninger. Biom. J. 35: 3: 299-314.
10. Haldane, J. B. S. 1939. Prøvetakingsfeil ved bestemmelse av bakteriell eller virustetthet ved fortynningsmetoden. J. Hygiene. 39:289-293.
11. Halvorson, H. O. og N. R. Ziegler. 1933. Anvendelse av statistikk til problemer i bakteriologi. J. Bakteriol. 25:101-121; 26:331-339; 26:559-567.
12. Jarvis B, Wilrich C, Wilrich P-T (2010). «Revurdering av avledning Av Mest Sannsynlige Tall, deres standardavvik, konfidensgrenser og sjeldenhetsverdier.»Tidsskrift For Anvendt Mikrobiologi, 109, 1660-1667.
13. McCrady, M. H. 1915. Den numeriske tolkningen av fermenteringsrøret resulterer. J. Infisere. Dis. 17:183-212.
14. Peeler, J. T., G. A. Houghtby og A. P. Rainosek. 1992. Den mest sannsynlige tallteknikken, Kompendium Av Metoder for Mikrobiologisk Undersøkelse Av Matvarer, 3.Utg., 105-120.
15. Thomas, H. A. 1942. Bakterielle tettheter fra gjæringsrørtester. J. Am. Vann Fungerer Assoc. 34:572-576.
16. Woodward, R. L. 1957. Hvor sannsynlig er det mest sannsynlige tallet? J. Am. Vann Fungerer Assoc. 49:1060-1068.

Tabeller

• Tabell 1. 3 rør hver
• Tabell 2. 5 rør hver
• Tabell 3. 10 rør hver
• Tabell 4. 8 rør hver
• Tabell 5. 10 rør ved 10 ml inokula (Lagt til juli 2003)

(Lagt juli 2003)

Last ned Et Excel-regneark for å beregne verdier (zip-fil).

merk: konfidensintervallene i regnearket og tabellene som er knyttet til dette vedlegget, kan være forskjellige. MPN Excel-regnearket bruker en normal tilnærming til loggen (MPN) for å beregne konfidensintervallene. Denne tilnærmingen ligner en normal tilnærming diskutert I Haldane (1939). Denne tiln rmingen er mindre beregningsmessig intens, sa mer passende for et regneark enn De Manns konfidensintervaller.