Protein Rensing Teknikker

  • Dr. Liji Thomas,MD Av Dr. Liji Thomas, Mdrevet Av Afsaneh Khetrapal ,BSc

    Protein engineering teknikker er en viktig del av å tilpasse eller produsere proteiner med spesifikke egenskaper som kan brukes i ulike industrielle prosesser. Dermed er de avgjørende for bioteknologisk forskning.

    disse metodene er imidlertid avhengige av å kunne isolere og rense de ønskede proteinene slik at deres fysiske og kjemiske egenskaper kan forstås, sammen med deres tertiære strukturer og interaksjoner med ligander og substrater.

    intensiteten som denne renseprosessen forfølges avhenger av bruken som proteinet skal settes på. For eksempel må farmasøytiske og matproteiner bringes til en høy grad av renhet, og passere gjennom flere sekvensielle trinn, så få som mulig, siden hvert trinn vil noe protein uunngåelig gå tapt.

    Rensing av proteinmolekyler er enklere enn rensing av proteinkomplekser.

    Trinn 1: Opprette Et Råproteinekstrakt

    Råekstrakter av intracellulære proteiner fremstilles ved å lysere cellen ved hjelp av kjemiske eller mekaniske prosesser. Avfallet fjernes deretter ved sentrifugering. Den resulterende supernatenten er langt fra ren form, blandet med mange andre makro – og mikromolekyler.

    Ekstracellulære proteiner oppnås ved sentrifugering av løsningen og fjerning av cellene. En spesifikk metode for å oppnå et rå ekstrakt av termostabile enzymer er å varme opp blandingen for å denaturere andre proteiner, og deretter avkjøle den for å reformere de termostabile proteinene av interesse, til slutt sentrifugere den for å fjerne de denaturerte proteinene.

    Trinn 2: Mellomrensing

    Salting Ut

    Proteiner i et rå ekstrakt renses neste ved å utfelle dem i en høyt konsentrert saltløsning, for eksempel ammoniumsulfat. Dette virker på grunnlag av lavere oppløselighet av protein ved høye konsentrasjoner av salt. Imidlertid faller ikke alle proteiner i samme konsentrasjon av salt, noe som betyr at salting også bidrar til å fraksjonere proteiner. Det kan også brukes til å konsentrere proteiner i oppløsning. Dette trinnet øker renheten tre ganger og 92% av proteinet i løsningen gjenvinnes.

    Dialyse

    Proteiner er store molekyler, og dette betyr at proteinsaltene beholdes ved å føre løsningen gjennom en semipermeabel membran. Cellulose er en typisk dialysemembran. Dialyse kan ikke brukes til å separere proteiner med forskjellig molekylvekt.

    Kromatografi

    Andre teknikker som brukes til å fjerne saltede proteiner inkluderer gelekskluderingskromatografi og filtrering. Disse er nå tilgjengelige som preformede sett for mange standardproteiner, og er ofte egnet for store prosesser.

    Gelfiltrering fungerer på grunnlag av størrelseseparasjon gjennom en kolonne av porøse polymerperler, som dextran eller agarose. De store molekylene kan bare strømme gjennom mellomrommene mellom perlene, mens de mindre opptar begge disse mellomrom og plassen inne i perlene, og senker dem ned. Dermed inneholder eluenten molekyler som kommer opp i rekkefølge av deres størrelse, fra største til minste. Omvendt fase eller ionbytterteknikker for kromatografi brukes også, som opererer på grunnlag av differensial hydrofobe egenskaper og ladning henholdsvis. Omvendt-fase kromatografi kan være begrenset i sin anvendelse på grunn av mulig protein denaturering av organiske løsemidler.

    Dialyse og ionebytte resulterer i en løsning som er 9 ganger så ren, men med bare 77% av det opprinnelige proteinet som nå er tilgjengelig. Etter gelekskluderingskromatografi er utbyttet bare 50% , men renheten er 100 ganger.

    Trinn 3: Endelig Rensing

    Affinitetskromatografi

    denne prosessen avhenger av bruk av ligander bundet til perler som binder spesifikt til proteinet av interesse som deretter kan skylles ut med en annen løsning av frie ligander. Dette resulterer i ekstremt rene proteinprøver som har den høyeste spesifikke aktiviteten blant alle teknikker i vanlig bruk. Et eksempel er rensingen av concanavalin A bruke glukoserester festet til perler i en kolonne. Løsningen er nå 3000 ganger renere, men utbyttet er bare 35% av det opprinnelige proteinet.

    Polyakrylamidgelelektroforese

    Polyakrylamidgelelektroforese brukes til å oppdage renheten av proteinprøven etter hvert trinn basert på størrelsen. Nettoladningen på molekylet gjør at den beveger seg ned i gelkolonnen eller arket i et elektrisk felt, noe som gjør det mulig å skille proteinene basert på deres migrasjonshastighet, som igjen avhenger av deres ladning, så vel som friksjonen og feltstyrken. Gelen virker som et kjemisk inert og lettformet filter, med proteinmolekyler som er nesten immobile i kolonnen fordi de sitter fast mellom de mye mindre porene mellom gelens molekyler. I utgangspunktet vises en serie bånd som representerer forskjellige proteiner i blandingen, som gradvis reduseres i antall til det siste trinnet viser bare ett bånd.

    Immunoblotting

    Immunoblotting er en annen nyttig teknikk som ofte kombineres med affinitetskromatografi. Det bruker antistoffer for at proteinet skal isoleres som ligander i kolonnen. Noen ganger er antistoffet festet til isotoper eller fargestoffer for å merke dem og gjøre det lettere etter separasjon.

    enhver kromatografisk teknikk forbedres ved å bruke trykk for å tvinge løsningen gjennom en kolonne av finfordelte materialer, enten ladede eller ligandbundne perler. Det økte overflatearealet resulterer i større interaksjon som presser opp oppløsningen og hastigheten til teknikken. Dette kalles høyytelses væskekromatografi (HPLC).

    Alle disse trinnene er inkludert i den ideelle ordningen, som må konsentrere seg om både utbytte og rensningsnivåer for å gi tilstrekkelige mengder protein til å løpe gjennom et eksperiment, samt gi tilstrekkelig renhet for å gjøre tolkningen relativt enkel.

    1. https://www.thebalance.com/methods-for-protein-purification-375683
    2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22410/
    3. https://info.gbiosciences.com/blog/bid/154230/what-is-protein-purification-and-what-techniques-are-used-during-this-process
    4. https://brf.anu.edu.au/files/protein_purification_handbook_0.pdf

    Videre Lesing

    • Alt Kromatografiinnhold
    • Oversikt Over Kromatografi
    • Gasskromatografi-Massespektrometri (GC-MS) Applikasjoner
    • Væskekromatografi Med Høy Ytelse (hplc)
    • Væskekromatografi-Massespektrometri (LC-MS) Applikasjoner
    Dr. Med. Liji Thomas

    Skrevet av

    Dr. Liji Thomas

    Dr. Liji Thomas ER EN OB-GYN, som ble uteksaminert Fra Regjeringen Medical College, University Of Calicut, Kerala, I 2001. Liji praktiserte som heltidskonsulent i obstetrik/gynekologi på et privat sykehus i noen år etter eksamen. Hun har rådet hundrevis av pasienter som står overfor problemer fra graviditetsrelaterte problemer og infertilitet, og har vært ansvarlig for over 2000 leveranser, og strever alltid for å oppnå en normal levering i stedet for operativ.

    Sist oppdatert Februar 26, 2019

    Sitater

    vennligst bruk en av følgende formater for å sitere denne artikkelen i essay, papir eller rapport:

    • TFO

      Thomas, Liji. (2019, 26. februar). Protein Rensing Teknikker. Nyheter-Medisinsk. Hentet 26. Mars 2021 fra https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

    • MLA

      Thomas, Liji. «Proteinrensingsteknikker». Nyheter-Medisinsk. 26. Mars 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx>.

    • Chicago

      Thomas, Liji. «Proteinrensingsteknikker». Nyheter-Medisinsk. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (besøkt 26. Mars 2021).

    • Harvard

      Thomas, Liji. 2019. Protein Rensing Teknikker. Nyheter-Medisinsk, sett 26 Mars 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.