Protein oprensningsteknikker

  • Dr. Liji Thomas, MDaf Dr. Liji Thomas, Mdrevieret af Afsaneh Khetrapal, BSc

    Proteintekniske teknikker er en væsentlig del af tilpasning eller produktion af proteiner med specifikke egenskaber, som kan anvendes i forskellige industrielle processer. De er således afgørende for bioteknologisk forskning.

    disse metoder afhænger imidlertid stærkt af at være i stand til at isolere og rense de ønskede proteiner, så deres fysiske og kemiske egenskaber kan forstås sammen med deres tertiære strukturer og interaktioner med ligander og substrater.

    den intensitet, som denne rensningsproces forfølges, afhænger af, hvilken anvendelse proteinet skal anvendes til. For eksempel skal farmaceutiske og fødevareproteiner bringes til en høj grad af renhed og passere gennem flere sekventielle trin, så få som muligt, da der ved hvert trin uundgåeligt vil gå noget protein tabt.

    oprensning af proteinmolekyler er enklere end rensende proteinkomplekser.

    Trin 1: Oprettelse af et Råproteinekstrakt

    Råekstrakter af intracellulære proteiner fremstilles ved at lysne cellen ved hjælp af kemiske eller mekaniske processer. Affaldet fjernes derefter ved centrifugering. Den resulterende supernatent er langt fra ren form, der blandes med mange andre makro-og mikromolekyler.

    ekstracellulære proteiner opnås ved centrifugering af opløsningen og fjernelse af cellerne. En særlig metode til at opnå et råekstrakt er at opvarme blandingen for at denaturere andre proteiner og derefter afkøle den for at reformere de termostabile proteiner af interesse og til sidst centrifugere den for at fjerne de denaturerede proteiner.

    Trin 2: Mellemrensning

    saltning ud

    proteiner i et råekstrakt renses næste ved udfældning af dem i en stærkt koncentreret saltopløsning, såsom ammoniumsulfat. Dette virker på basis af den lavere opløselighed af protein ved høje koncentrationer af salt. Imidlertid udfældes alle proteiner ikke ved den samme koncentration af salt, hvilket betyder, at saltning også hjælper med at fraktionere proteiner. Det kan også bruges til at koncentrere proteiner i opløsning. Dette trin øger renheden tre gange, og 92% af proteinet i opløsningen genvindes.

    dialyse

    proteiner er store molekyler, og dette betyder, at proteins salte bevares ved at føre opløsningen gennem en semipermeabel membran. Cellulose er en typisk dialysemembran. Dialyse kan ikke bruges til at adskille proteiner med forskellige molekylvægte.

    kromatografi

    andre teknikker, der anvendes til at fjerne saltede proteiner, omfatter geleksklusionskromatografi og filtrering. Disse er nu tilgængelige som præformede sæt til mange standardproteiner og er ofte egnede til store processer.

    gelfiltrering fungerer på basis af størrelsesseparation gennem en søjle af porøse polymerperler, såsom dekstran eller agarose. De store molekyler kan kun strømme gennem mellemrummet mellem perlerne, mens de mindre optager både disse rum og rummet inde i perlerne og bremser dem ned. Således indeholder eluenten molekyler, der opstår i rækkefølge efter deres størrelse, fra største til mindste. Omvendt fase-eller ionbytningsteknikker for kromatografi anvendes også, der opererer på basis af henholdsvis differentielle hydrofobe egenskaber og ladning. Kromatografi med omvendt fase kan være begrænset i dens anvendelse på grund af mulig proteindenaturering med organiske opløsningsmidler.

    dialyse og ionbytning resulterer i en opløsning, der er 9 gange så ren, men hvor kun 77% af det oprindelige protein nu er tilgængeligt. Efter geludelukkelseskromatografi er udbyttet kun 50%, men renheden er 100 gange.

    Trin 3: endelig oprensning

    affinitetskromatografi

    denne proces afhænger af anvendelse af ligander bundet til perler, der binder specifikt til proteinet af interesse, som derefter kan skylles ud med en anden opløsning af frie ligander. Dette resulterer i ekstremt rene proteinprøver, der har den højeste specifikke aktivitet blandt alle teknikker til almindelig brug. Et eksempel er oprensningen af concanavalin A ved anvendelse af glucoserester fastgjort til perler i en søjle. Løsningen er nu 3000 gange renere, men udbyttet er kun 35% af det oprindelige protein.

    Polyacrylamidgelelektroforese

    Polyacrylamidgelelektroforese anvendes til at detektere renheden af proteinprøven efter hvert trin baseret på størrelsen. Netladningen på molekylet får det til at bevæge sig ned ad gelkolonnen eller arket i et elektrisk felt, hvilket gør det muligt at adskille proteinerne baseret på deres migrationshastighed, hvilket igen afhænger af deres ladning såvel som friktionen og feltstyrken. Gelen fungerer som et kemisk inert og let dannet filter, hvor proteinmolekyler næsten er immobile i søjlen, fordi de sidder fast mellem de meget mindre porer mellem gelens molekyler. Oprindeligt vises en række bånd, der repræsenterer forskellige proteiner i blandingen, som gradvist reduceres i antal, indtil det sidste trin kun viser et bånd.

    Immunoblotting

    Immunoblotting er en anden nyttig teknik, der ofte kombineres med affinitetskromatografi. Det bruger antistoffer til proteinet, der skal isoleres som ligander i søjlen. Nogle gange er antistoffet bundet til isotoper eller farvestoffer for at mærke dem og gøre detektion lettere efter adskillelse.

    enhver kromatografisk teknik forbedres ved at anvende tryk til at tvinge opløsningen gennem en søjle af fint opdelte materialer, hvad enten det er ladede eller ligandbundne perler. Det øgede overfladeareal resulterer i større interaktion, som skubber op opløsningen og hastigheden af teknikken. Dette kaldes højtydende væskekromatografi (HPLC).

    alle disse trin er inkluderet i det ideelle skema, som skal koncentrere sig om både udbytte-og oprensningsniveauer for at tilvejebringe tilstrækkelige mængder protein til at løbe gennem et eksperiment samt give tilstrækkelig renhed til at gøre fortolkningen relativt ligetil.

    1. https://www.thebalance.com/methods-for-protein-purification-375683
    2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22410/
    3. https://info.gbiosciences.com/blog/bid/154230/what-is-protein-purification-and-what-techniques-are-used-during-this-process
    4. https://brf.anu.edu.au/files/protein_purification_handbook_0.pdf

    yderligere læsning

    • alt Kromatografiindhold
    • Kromatografioversigt
    • gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS) applikationer
    • højtydende væskekromatografi (HPLC)
    • væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) applikationer
    Dr. med. Thomas

    skrevet af

    Dr. Liji Thomas

    Dr. Liji Thomas er en OB-GYN, der dimitterede fra Government Medical College, University of Calicut, Kerala, i 2001. Liji praktiserede som fuldtidskonsulent i obstetrik/gynækologi på et privat hospital i et par år efter hendes eksamen. Hun har rådgivet hundreder af patienter, der står over for problemer fra graviditetsrelaterede problemer og infertilitet, og har været ansvarlig for over 2.000 fødsler og stræber altid efter at opnå en normal fødsel snarere end operativ.

    sidst opdateret Feb 26, 2019

    citater

    brug et af følgende formater til at citere denne artikel i dit essay, papir eller rapport:

    • APA

      Thomas, Liji. (2019, 26. februar). Protein Oprensningsteknikker. Nyheder-Medicinsk. Hentet den 26. marts 2021 fra https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

    • MLA

      Thomas, Liji. “Protein Oprensningsteknikker”. Nyheder-Medicinsk. 26. marts 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx>.

    • Chicago

      Thomas, Liji. “Protein Oprensningsteknikker”. Nyheder-Medicinsk. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (adgang til 26. marts 2021).

    • Harvard

      Thomas, Liji. 2019. Protein Oprensningsteknikker. Nyheder-medicinsk, set 26. marts 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.