Čištění proteinů Techniky

  • Dr. Liji Thomas, MDDr. Liji Thomas, MDReviewed tím, Afsaneh Khetrapal, BSc

    Proteinové inženýrství techniky jsou nezbytnou součástí přizpůsobení nebo produkovat proteiny se specifickými vlastnostmi, které mohou být použity v různých průmyslových procesech. Proto jsou klíčové pro biotechnologický výzkum.

    Nicméně, tyto metody silně závisí na schopnosti izolovat a očistit požadované proteiny tak, aby jejich fyzikální a chemické vlastnosti lze chápat, spolu s jejich terciární struktury a interakcí s ligandy a substráty.

    intenzita, na kterou se tento proces čištění provádí, závisí na použití, do kterého má být protein vložen. Například farmaceutické a potravinářské proteiny musí být přivedeny na vysoký stupeň čistoty a projít několika postupnými kroky, co nejméně, protože v každém kroku se nevyhnutelně ztratí nějaký protein.

    čištění proteinových molekul je jednodušší než čištění proteinových komplexů.

    Krok 1: Vytvoření extraktu surového proteinu

    surové extrakty intracelulárních proteinů se připravují lýzou buňky chemickými nebo mechanickými procesy. Zbytky se pak odstraní odstředěním. Výsledný supernatent je daleko od čisté formy a je smíchán s mnoha dalšími makro a mikromolekuly.

    extracelulární proteiny se získají odstředěním roztoku a odstraněním buněk. Konkrétní způsob získání surového extraktu termostabilní enzymy je směs tak, aby došlo k denaturaci jiných proteinů, a pak ji vychladnout na reformu termostabilní proteiny zájmu, konečně odstředění je odstranit denaturované proteiny.

    Krok 2: Průběžné Čištění

    Solení

    Proteinů v surovém extraktu jsou další čištěn urychlovat je vysoce koncentrovaný roztok soli, jako je síran amonný. To funguje na základě nižší rozpustnosti bílkovin při vysokých koncentracích soli. Všechny proteiny se však nesrážejí ve stejné koncentraci soli, což znamená, že solení také pomáhá frakcionovat proteiny. Může být také použit k koncentraci proteinů v roztoku. Tento krok zvyšuje čistotu třikrát a obnoví se 92% proteinu v roztoku.

    Dialýzu

    Proteiny jsou velké molekuly, a to znamená, bílkoviny, soli, bude zachován při průchodu roztoku přes polopropustnou membránu. Celulóza je typická dialyzační membrána. Dialýzu nelze použít k oddělení proteinů různých molekulových hmotností.

    chromatografie

    další techniky používané k odstranění solených proteinů zahrnují gelovou vylučovací chromatografii a filtraci. Ty jsou nyní k dispozici jako předem vytvořené sady pro mnoho standardních proteinů a jsou často vhodné pro rozsáhlé procesy.

    gelová filtrace funguje na základě separace velikosti kolonou porézních polymerních kuliček, jako je dextran nebo agaróza. Velké molekuly mohou proudit pouze mezerami mezi korálky, zatímco menší zabírají jak tyto prostory, tak prostor uvnitř korálků a zpomalují je. Eluent tedy obsahuje molekuly vznikající v pořadí podle jejich velikosti, od největší po nejmenší. Používají se také techniky reverzní fáze nebo iontoměničové chromatografie, které pracují na základě diferenciálních hydrofobních vlastností a náboje. Chromatografie s obrácenou fází může být při aplikaci omezena kvůli možné denaturaci proteinů organickými rozpouštědly.

    dialýza a iontová výměna vedou k roztoku, který je 9krát čistší, ale nyní je k dispozici pouze 77% původního proteinu. Po gelové vylučovací chromatografii je výtěžek pouze 50%, ale čistota je 100krát.

    Krok 3: Konečné Čištění

    Afinitní Chromatografie

    Tento proces závisí na použití ligandů vázaný na korálky, které se váží specificky na protein zájmu, které pak mohou být opláchnout s další roztok zdarma ligandy. Výsledkem jsou extrémně čisté vzorky bílkovin, které mají nejvyšší specifickou aktivitu ze všech běžně používaných technik. Příkladem je čištění konkanavalinu a za použití zbytků glukózy připojených k kuličkám ve sloupci. Roztok je nyní 3000krát čistší, ale výtěžek je pouze 35% původního proteinu.

    Polyakrylamidovém Gelu Elektroforéza

    Polyakrylamidovém gelu elektroforéza se používá k detekci čistoty proteinu vzorku po každém kroku na základě velikosti. Celkový náboj na molekule umožňuje pohyb dolů gel sloupec listu nebo v elektrickém poli, takže je možné oddělit proteiny na základě jejich rychlost migrace, která zase závisí na jejich starosti, stejně jako tření a síly pole. Gel působí jako chemicky inertní a snadno vytvořeny filtr, s molekuly bílkovin byl téměř nepohyblivý ve sloupci, protože oni jsou přilepená mezi mnohem menší póry mezi molekulami gelu. Zpočátku je zobrazena řada pásů, které představují různé proteiny ve směsi, které postupně snižují počet až do posledního kroku ukazuje pouze jeden pás.

    imunoblotování

    imunoblotování je další užitečnou technikou často kombinovanou s afinitní chromatografií. Používá protilátky pro protein, který má být izolován jako ligandy ve sloupci. Někdy je protilátka připojena k izotopům nebo barvivům, aby je označila a usnadnila detekci po separaci.

    jakákoli chromatografická technika se zlepší použitím tlaku, aby se roztok protlačil kolonou jemně rozdělených materiálů, ať už nabitých nebo ligandem vázaných kuliček. Zvětšená plocha povrchu vede k větší interakci, která zvyšuje rozlišení a rychlost techniky. Toto se označuje jako vysoce výkonná kapalinová chromatografie (HPLC).

    Všechny tyto kroky jsou zahrnuty v ideální schéma, které se musí soustředit na oba výnos a čištění úrovních s cílem poskytnout dostatečné množství bílkovin projít experiment, stejně jako poskytnout dostatečnou čistotu, aby se výklad poměrně jednoduché.

    1. https://www.thebalance.com/methods-for-protein-purification-375683
    2. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22410/
    3. https://info.gbiosciences.com/blog/bid/154230/what-is-protein-purification-and-what-techniques-are-used-during-this-process
    4. https://brf.anu.edu.au/files/protein_purification_handbook_0.pdf

    Další Čtení

    • Všechny Chromatografie Obsah
    • Chromatografie Přehled
    • Plynová Chromatografie-Hmotnostní Spektrometrie (GC-MS) Aplikace
    • vysokoúčinná kapalinová Chromatografie (HPLC)
    • kapalinová Chromatografie-Hmotnostní Spektrometrie (LC-MS) Aplikace
    Dr. Liji Thomas

    Napsal

    Dr. Liji Thomas

    Dr. Liji Thomas je OB-GYN, který absolvoval vládní Lékařskou fakultu, University of Calicut, Kerala, v roce 2001. Liji několik let po ukončení studia praktikovala jako konzultantka na plný úvazek v porodnictví/gynekologii v soukromé nemocnici. Ona poradil stovky pacientů, kteří čelí problémy od těhotenství-související problémy a neplodnost, a má na starosti více než 2000 dodávky, snaží se vždy dosáhnout normálním porodu, spíše než funkční.

    Poslední aktualizované Feb 26, 2019

    Citace

    použijte jeden z následujících formátů citovat tento článek ve vašem esej, papír nebo zprávy:

    • APA

      Thomas, Liji. (2019, 26. února). Techniky Čištění Proteinů. Novinky-Lékařské. Citováno 26. března 2021 z https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

    • MLA

      Thomas, Liji. „Techniky Čištění Proteinů“. Novinky-Lékařské. 26. Března 2021. <https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx>.

    • Chicago

      Thomas, Liji. „Techniky Čištění Proteinů“. Novinky-Lékařské. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (přístup k 26. březnu 2021).

    • Harvard

      Thomas, Liji. 2019. Techniky Čištění Proteinů. News-Medical, zobrazeno 26 březen 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.